Nhằm cải tiến kỹ thuật COLD-PCR - kỹ thuật làm giàu đột biến hiếm trong quần thể bằng cách biến tính ở nhiệt độ thấp COLD - làm cơ sở phát triển kỹ thuật mới LNA-probe Real-time COLD- PCR phát hiện các đột biến kháng thuốc NAs hiện được sử dụng điều trị và ứng dụng các kỹ thuật này để khảo sát tần xuất xuất hiện và tỷ lệ quần thể đột biến đã biết và phát hiện đột biến mới kháng thuốc ở HBV trên bệnh nhân viêm gan B chưa điều trị và bệnh nhân viêm gan mạn tính.
Cụ thể: Xây dựng hệ thống mẫu chuẩn plasmid tái tổ hợp mang các bản sao HBV thể dại và đột biến kháng thuốc. Phát triển kỹ thuật COLD-PCR với mục tiêu phát hiện tất cả các đột biến (đã biết và mới) và LNAprobe Real-time PCR/COLD-PCR với những đột biến kháng 3 nhóm thuốc NA: Lamivudine/Telbivudine, Adefovir/Tenofovir, và Entecavir. Khảo sát tần xuất xuất hiện và tỷ lệ quần thể đột biến đã biết và sàng lọc phát hiện các đột biến mới kháng thuốc ở HBV trên bệnh nhân viêm gan B chưa điều trị và bệnh nhân viêm gan mạn tính, PGS. TS. Phùng Thị Bích Thủy cùng các cộng sự tại Bệnh viện Nhi Trung ương đã thực hiện đề tài: “Phát triển kỹ thuật mới Real-time PCR biến tính ở nhiệt độ thấp sử dụng đầu dò Taqman Locked-nucleic Acid (LNA -probe Real-time COLD-PCR) có độ nhạy cao để phát hiện sớm tần suất và tỷ lệ quần thể đột biến kháng thuốc Nucleoside Analogs của virus HBV”.
Đề tài tiếp cận nghiên cứu bằng việc phát triển kỹ thuật COLD-PCR (kỹ thuật làm giàu đột biến hiếm trong quần thể bằng cách biến tính ở nhiệt độ thấp-COLD) kết hợp giải trình tự gen Sanger DNA sequencing để phát hiện các đột biến kháng thuốc NAs của HBV đang lưu hành ở quần thể người Việt Nam. Dựa trên thông tin các đột biến phát hiện được và một số đột biến kháng thuốc NA thế hệ mới được các nhóm nghiên cứu trên thế giới phát hiện gần đây, chúng tôi tập trung xây dựng hệ thống mẫu chuẩn plasmid tái tổ hợp mang đoạn chèn chứa các đột biến kháng thuốc khác nhau. Hệ thống mẫu chuẩn này sau đó được sử dụng làm cơ sở phát triển kỹ thuật LNA-probe realtime PCR và LNA-probe real-time COLD-PCR phát hiện và định lượng đột biến hiếm trong quần thể với độ nhạy cao. Kỹ thuật xét nghiệm phát triển trong nghiên cứu này bao gồm COLD-PCR và real time LNA-probe PCR/COLD-PCR được ứng dụng trong khảo sát tần xuất xuất hiện và tỷ lệ quần thể đột biến đã biết và sàng lọc phát hiện các đột biến mới kháng thuốc ở HBV trên bệnh nhân viêm gan B chưa điều trị và bệnh nhân viêm gan mạn tính. Từ đó, đánh giá hiệu quả và tiềm năng ứng dụng của các phương pháp này trong các xét nghiệm thường quy, và ý nghĩa thực tiễn trong việc lựa chọn thuốc cho bệnh nhân đến khám điều trị và thay đổi thuốc điều trị cho bệnh nhận viêm gan mạn tính có dấu hiệu kháng thuốc.
Sau một thời gian triển khai thực hiện, đề tài đưa ra các kết luận như sau:
- Đã xây dựng cơ sở dữ liệu, thiết kế thí nghiệm in silico; thiết kế và tổng hợp mồi, probe, đoạn chèn mang đột biến.
- Thu thập mẫu bệnh phẩm và thông tin tương ứng.
- Nhân dòng và xây dựng hệ thống mẫu chuẩn plasmid tái tổ hợp mang dạng thể dại và đột biến.
- Xây dựng phương pháp biến tính ở nhiệt độ thấp làm giàu đột biến hiếm trong quần thể COLD-PCR.
- Xây dựng kỹ thuật LNA-probe Real-time PCR phát hiện riêng lẻ từng đột biến.
- Xây dựng kỹ thuật LNA-probe Real-time PCR phát hiện đồng thời nhiều đột biến.
- Kết hợp kỹ thuật biến tính ở nhiệt độ thấp (COLD) làm giàu đột biến hiếm và kỹ thuật LNA-probe Real-time PCR để xây dựng kỹ thuật mới LNA-probe Real-time COLD-PCR.
- Tách DNA HBV từ mẫu bệnh phẩm và xét nghiệm đột biến kháng thuốc sử dụng các phương pháp: PCR giải trình tự Sanger và phương pháp mới để so sánh độ nhạy của kỹ thuật (n = 100-200).
- Tách DNA HBV từ mẫu bệnh phẩm và xét nghiệm đột biến kháng thuốc sử dụng kỹ thuật mới realtime PCR và real-time COLD-PCR LNA probe (n = 300-400).
- Phân tích thống kê và công bố khoa học.
Như vậy, nhóm nghiên cứu đã thực hiện đúng tiến độ các nội dung công việc và hoàn thành các sản phẩm đăng ký trong thuyết minh. Tuy vậy, do tình hình dịch Covid-19 kéo dài trong 2 năm 2020-2021, CNĐT phải chịu trách nhiệm chính trong việc xét nghiệm covid-19 tại bệnh viện Nhi Trung ương nên chưa tập trung được thời gian hoàn tất các thủ tục thanh quyết toán tài chính của đề tài.
Có thể tìm đọc toàn văn Báo cáo kết quả nghiên cứu của Đề tài (Mã số 19812/2021) tại Cục Thông tin khoa học và công nghệ quốc gia.
P.T.T (NASATI)
